Масс-спектрометрический метод анализа

Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MSn). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.

            FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>105) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16, где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m/z ионов.

         В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это – чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным. [16]

Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями:

Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m/z, поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17).

Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m/z. Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.

Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10-6 – 10-7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10-10 – 10-9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.

Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.

Детекторы

После того, как ионы разделены анализатором масс, они достигают ионного детектора (рис. 2.1 и 2.18-21), где генерируют токовый сигнал падающих ионов. Самым распространённым детектором является электронный умножитель, который передаёт кинетическую энергию падающих ионов на поверхность, где она, в свою очередь, генерирует вторичные электроны. Однако, существует множество подходов, зависящих от типа масс-спектрометра.

Электронный умножитель

Пожалуй, большинство устройств детектирования ионов включают в себя электронный умножитель (рис. 3.1), который сделан из серии (от 12 до 24) динодов из оксида алюминия, поддерживаемых под увеличивающимся

потенциалом. Ионы ударяют в поверхность первого динода, вызывая испускание электронов. Эти электроны затем притягиваются к следующему диноду, имеющему больший потенциал, и поэтому генерируется больше вторичных электронов. В конце концов, после включения значительного числа динодов, образуется каскад электронов, который даёт общий ток больше в миллион раз и даже ещё больше.

Высокоэнергетический динод (HED) использует ускоряющее электростатическое поле для увеличения скорости ионов. Так как сигнал электронного умножителя сильно зависит от скорости иона, HED служит для увеличения интенсивности сигнала, а, следовательно, и чувствительности.

Цилиндр Фарадея

Включает в себя удар ионов по поверхности динода (BeO, GaP или CsSb), который вызывает выброс вторичных электронов. Этот временный выброс электронов вызывает положительный заряд на детекторе, и поэтому ток электронов по направлению к детектору. Такой детектор не особенно чувствителен, давая очень ограниченное усиление сигнала, но зато он устойчив к относительно высокому давлению.

Фотоумножитель с преобразующим динодом

Фотоумножитель с преобразующим динодом (рис. 3.3) не является обычно используемым электронным умножителем, хотя он похож на него по устройству: вторичные электроны ударяют в фосфоресцирующий экран вместо динода. Фосфоресцирующий экран высвобождает фотоны, которые детектируются фотоумножителем. Фотоумножители действуют так же, как электронные: в них падающий на сцинтилляционную поверхность фотон вызывает высвобождение электронов, которое усиливается по каскадному принципу. Преимуществом преобразующего динода является то, что трубка фотоумножителя герметично вакуумирована, не подвержена воздействию среды масс-спектрометра и, тем самым, исключена возможность её загрязнения. Это увеличивает срок службы таких детекторов по сравнению с обычными электронными умножителями. Обычно срок службы увеличивается на пять лет притом, что они имеют такую же чувствительность, что и электронные умножители.

Матричный детектор

Линейный детектор – группа индивидуальных детекторов, расположенных в матрицу. Матричный детектор, который пространственно определяет ионы в зависимости от их m/z, обычно используется с анализаторами масс магнитного сектора. Пространственно разделённые ионы могут быть детектированы одновременно матричным детектором. Основным преимуществом такого подхода является то, что при малом диапазоне масс, нет необходимости в сканировании, и поэтому увеличивается чувствительность. [1]

Зарядовый (индуктивный) детектор

Зарядовый детектор просто распознаёт движущуюся заряженную частицу (ион) по тому, как она индуцирует ток на электроде просто из-за своего быстрого движения. Обычный сигнал показан на рис. 3.4. Этот тип детектирования широко применяется в FTMS, чтобы генерировать экранирующий ток иона. Детектирование не зависит от размера иона и поэтому может применяться к таким частицам, как целые вирусы.

Таблица 3.1. Общее сравнение детекторов.

Вакуум масс-спектрометра

Всем масс-спектрометры нужен вакуум, чтобы ионы могли достичь детектора без столкновений с другими газообразными молекулами или атомами. Если такие столкновения случаются, прибор подвержен уменьшению разрешения и чувствительности. Высокие давления также могут вызывать разряд напряжений в землю, что может повредить прибор, его электронику или компьютерную систему, обслуживающую масс-спектрометр. Мощная утечка, и основанный на ней прорыв атмосферы внутрь прибора, может серьёзно повредить масс-спектрометр, уничтожив электростатические линзы, забрызгав оптику насосным маслом или повредив детектор. В общем, поддержание хорошего вакуума является ключевым моментом в получении высококачественных спектров.

Одним из первых препятствий, встреченных изобретателями масс-спектрометрии, было совмещение источника образцов и масс-спектрометра. Образцы, находящиеся при атмосферном давлении (760 Торр) перед помещением в вакуум масс-спектрометра (~10-6 Торр), что является разностью в давлении приблизительно в миллиард раз. Одним из подходов является введение образца через капиллярную колонку (ГХ) или через малое входное отверстие непосредственно в прибор. Другим подходом является изолирование камеры ввода образца при помощи вакуумного клапана (MALDI) и, после достижения приемлемого вакуума над образцом (<10-2 Торр) образец может быть представлен в основную часть вакуумной камеры (<10-5 Торр).

Выводы

Масс-спектрометрия становится важным методом анализа биологических и небиологических макромолекул. Она является одним из самых чувствительных и точных методов, способным определять всего лишь сотни молекул, уступая в этом только радиационным методам анализа. Разрешение некоторых методов достигает 30000, что означает точность порядка десятков ppm. Такая точность даёт возможность изотопного анализа макромолекул, таких, как белки, а также определения дефекта массы и расчёта брутто-формулы лёгких молекул и даже белков только по данным определения молекулярной массы и изотопного распределения.

Фрагментарная информация, особенно при использовании тандемной масс-спектрометрии даёт возможность определять структуру молекулы, а также, в ограниченных масштабах, механизмы газофазных реакций и реакционные центры исследуемых молекул.

Вместе с тем, масс-спектрометрия является одним из самых дорогих методов анализа, наряду с ЯМР-спектрометрией, уступая в этом только рентгеноструктурному анализу. Это обусловлено, главным образом, необходимостью организации высокого вакуума внутри прибора и связанных с этим трудностей при выборе оборудования.

Список использованной литературы

1.                             Dole M, Mack LL, Hines RL, Mobley RC, Ferguson LD, Alice MB. Molecular beams of macroions. Journal of Chemical Physics. 1968, 49:5, 2240.

2.                             Whitehouse CM, Dreyer RN, Yanashita M, Fenn JB. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers. Anal. Chem. 1985, 57, 675-679.

3.                             Tanaka K, Waki H, Ido Y, Akita S, Yoshida Y, Yoshida T. Protein and polymer analysis up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.

4.                             Karas M & Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular mass exceeding 10,000 Daltons. Anal. Chem. 1988, 60, 2299.

5.                             Bruins AP. Mechanistic aspects of electrospray ionization. J. Chromatogr. A, 1998, 795, 345-357.

6.                             Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM. Electrospray ionization - principles and practice. Mass Spectrometry Reviews. 1990, 9, 37.

7.                             McLafferty FW & Turecek F. Interpretation of Mass Spectra. 4th ed. Mill Valley, Calif. : University Science Books, 1993.

8.                             Cole R (Editor). Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications. New York: Wiley and Sons, 1997.

9.                             Cole RB. Some tenets pertaining to electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 763-772.

10.                         Kebarle P. A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 804-817.

11.                         Gaskell SJ. Electrospray: principles and practice. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 677-688.

12.                         Cech NB and Enke CG. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387.

13.                         Busch K.L., Glish G.L., McLuckey S.A. Mass Spectrometry/Mass Spectrometry: Techniques and Applications of Tandem. John Wiley & Sons, 1989.

14.                         Cotter R. Time-Of-Flight Mass Spectrometry: Instrumentation and Applications in Biological Research. Washington, D.C.: ACS, 1997.

15.                         McCloskey J.A. & Simon M.I. Methods in Enzymology: Mass Spectrometry. Academic Press, 1997.

16.                         Kinter M. & Sherman NE. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Wiley-Interscience, 2000.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6