Масс-спектрометрический метод анализа
MALDI и ESI сейчас являются самыми распространёнными способами ионизаций
для биомолекулярной масс-спектрометрии, с их превосходными диапазонами масс и
чувствительностью (рис. 1.3). Следующий раздел будет посвящён основам способов ионизации,
рассматривая некоторые детали в практических аспектах их применения наряду с механизмами
ионизации.
Ионизация электроспрея (ESI)
Идея
электроспрея, хоть и не нова, была возрождена в связи с её настоящим применением
к биомолекулам. Первые эксперименты с электроспреем были проведены Чепменом в
поздних 1930-х, а практическое развитие ионизации электроспрея для
масс-спектрометрии было завершено Доулом в поздних 1960-х. Доул также открыл
важное явление множественной зарядки молекул. Работы Фенна окончательно привели
к современной технике ионизации электроспрея в масс-спектрометрии и её
применению для биологических молекул.
Суть ESI заключается в следующем.
Электрическое напряжение на игле приводит к большому электрическому градиенту
на жидкости, который разделяет заряды на поверхности. Это вынуждает жидкость
выпячиваться с иглы в форме конуса Тейлора. Верхушка конуса вытягивается в нить
до тех пор, пока не достигнет предела Рэлея, при котором поверхностное натяжение
и электростатическое отталкивание сравняются и сильно заряженная капля не
оторвётся от нити. Капли, которые оторвались от конуса, притягиваются к входу в
масс-спектрометр из-за большой разности потенциалов между иглой и входом в
масс-анализатор. По мере продвижения капли к анализатору кулоновское
отталкивание на поверхности превосходит поверхностное натяжение и капля «взрывается»,
окончательно высвобождая ионы.[3]
Ионизация электроспрея
– метод, который обычно применяется для пептидов, белков, углеводов, малых
олигонуклеотидов, синтетических полимеров и липидов. ESI производит газообразные заряженные
молекулы прямо из жидкого раствора. Ионизация происходит при создании тонкого
спрея сильно заряженных капель в присутствии электрического поля. Образец раствора
распыляется из области с сильным электрическим полем на конце металлической
форсунки, поддерживаемой при потенциале между 700 и 5000 В. Форсунка (или
игла), к которой приложен потенциал, служит для распыления раствора в тонкий
спрей заряженных капель. Использование сухого газа, нагревания или оба этих
способов применяется к заряженным каплям при атмосферном давлении для испарения
из них растворителя. С уменьшением размера капель возрастает плотность заряда
на их поверхности. Взаимное кулоновское отталкивание между одинаковыми зарядами
на этой поверхности становится настолько велико, что превосходит силы
поверхностного натяжения и ионы вырываются из капли через «конус Тейлора» - рис.
1.5. Другая возможность состоит в том, что капля взорвётся, высвобождая
ионы. В любом случае свободные ионы направляются в канал через
электростатические «линзы», направляясь в вакуум масс-анализатора. Так как ESI включает в себя непрерывную подачу
раствора, он применим для использования совместно с ВЭЖХ или капиллярным
электрофорезом.[4]
Ионизация электроспрея
благоприятствует образованию единично заряженных малых молекул, но также хорошо
известно образование в ходе неё многократно заряженных экземпляров больших
молекул. Это важное явление, т.к. масс-спектрометр измеряет отношение массы к
заряду (m/z) и поэтому многократная зарядка
делает возможным наблюдать очень большие молекулы при помощи инструмента с
относительно малым диапазоном масс. К счастью, программы, пригодные для всех
масс-спектрометров с электроспреем, позволяют произвести вычисления
молекулярной массы, необходимые для определения действительной массы
многозарядных образцов. Рис. 1.6 и 1.7 показывают различные заряженные
состояния двух различных белков, где каждый пик в масс-спектрах может быть
соотнесён с различными зарядовыми состояниями молекулярного иона. Многократная
зарядка имеет другие важные преимущества в тандемной масс-спектрометрии. Одно
из преимуществ состоит в том, что после фрагментации вы наблюдаете больше
фрагментарных ионов от многозарядного предшественника, чем от однозарядного.
Многократная зарядка: белок
с массой 10000 дальтон и его теоретический масс-спектр с зарядами до +5
показаны на рис. 1.8. Масса белка остаётся такой же в то время, как
отношение m/z меняется в зависимости от числа
зарядов на белке. Ионизация белка есть обычно результат протонирования, что не
только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных
протонов. Это действие на m/z применимо одинаково для любого
механизма ионизации молекулы, образовавшего положительно или отрицательно
заряженный молекулярный ион, включая присоединение или отрыв несущих заряд
частиц, отличных от протона (например, Na+ и Cs+). Многократные положительные заряды
наблюдаются для белков, в то время как для олигонуклеотидов типично образование
отрицательных зарядов (с ESI).
Хотя масс-спектрометры
электроспрея снабжены программами, которые подсчитывают молекулярный вес,
понимание, как компьютер производит эти вычисления для многократно-заряженных
ионов полезно. Уравнения 1.1 – 1.5 и рис. 1.9 представляют простое
объяснение, где мы принимаем, что пики p1 и p2 являются соседними и
различаются одним зарядом, что эквивалентно добавлению одного протона.
p = m/z
p1 = (Mr + z1)/z1
p2 = {Mr + (z1 - 1)}/(z1 - 1)
|
(1.1)
(1.2)
(1.3)
|
p – пик в масс-спектре
m – общая масса иона
z – полный заряд
Mr – средняя масса белка
|
p1 – значение m/z для p1
p2 – значение m/z для p2
z1 – заряд для пика p1
|
Уравнения 1.2. и
1.3. могут быть решены для двух неизвестных, Mr и z1.
Для пиков в
масс-спектре миоглобина, показанном на рис. 1.9, p1=1542,
p2=1696.
|
1542 z1 = Mr + z1
1696 (z1 - 1) = Mr + (z1 - 1)
Решив два уравнения, находим: Mr = 16,951 Da
для z1 = 11
|
(1.4)
(1.5)
|
Растворители для электроспрея
Многие
растворители могут быть использованы в ESI и выбираются в зависимости от растворимости исследуемых соединений,
летучести растворителя и способности растворителя к отдаче протона. Обычно,
основными являются протонные растворители, такие, как, метанол, 50/50 метанол/вода
или 50/50 ацетонитрил/вода, в то время как апротонные сорастоврители, такие,
как 10% ДМСО в воде, а также изопропиловый спирт, используются, чтобы улучшить
растворимость для некоторых соединений. Хотя 100% вода и используется в ESI, её относительно низкое давление
пара является определяющим фактором чувствительности; лучшая чувствительность
получается при добавлении летучего органического растворителя. Некоторые соединения
требуют использования чистого хлороформа с добавлением 0.1% муравьиной кислоты
для обеспечения ионизации. Такой подход, хоть и менее чувствительный, может
быть эффективен для соединений, не растворимых другим образом.[5]
Буферы, такие,
как Na+, K+, фосфат и соли представляют проблему для ESI из-за снижения давления пара капель,
ведущего к ослаблению сигнала из-за увеличения поверхностного натяжения капель,
ведущего к уменьшению летучести. Поэтому летучие буферы, такие, как ацетат аммония,
могут быть использованы более эффективно.[6]
Таблица 1.3. Преимущества и
недостатки ионизации электроспрея (ESI)
|
Преимущества
|
Недостатки
|
§
практический
диапазон масс до 70000 дальтон
§
хорошая
чувствительность от фемтомоль до нескольких пикомоль обычно
§
самый
мягкий метод ионизации, способный генерировать нековалентные комплексы в
газовой фазе
§
легко
адаптируется к жидкостной хроматографии
§
легко
адаптируется к тандемным масс-анализаторам, таким, как ионные ловушки и
тройные квадрупольные инструменты
§
многократная
зарядка позволяет производить анализ ионов с высокой массой на приборах с
относительно низким m/z диапазоном.
§
нет
помех от матрицы
|
§
присутствие
солей и веществ, образующих ионные пары, как, например, ТФА может уменьшить
чувствительность
§
сложные
смеси могут уменьшить чувствительность
§
одновременный
анализ смеси может быть неудовлетворительным
§
многократная
зарядка может быть запутанной, особенно при анализе смесей
§
важна чистота образца
§
перенос
от образца к образцу
|
|
Устройство прибора ионизации электроспрея
Неосевая
конфигурация ESI, которая сейчас используется
во многих приборах для введения ионов в анализатор (как показано на рис.
1.10), показала себя очень эффективной при использовании с большим потоком
жидкости. Основное преимущество такой конфигурации состоит в том, что скорость
потока может быть увеличена без засорения или закупоривания входного отверстия.
Неосевое распыление важно, потому что вход в анализатор более не насыщается
растворителем, тем самым предохраняя капли от попадания во входное отверстие и
его загрязнения. Наоборот, только ионы направляются ко входу. Это делает ESI ещё более совместимым с ЖХ при скоростях
до мл/мин.
Электроспрей низкого
потока, впервые описанный Вильмом и Манном, называли наноэлектроспреем,
наноспреем и микроэлектроспреем. Такой способ ионизации является вариацией ESI, в которой игла спрея сделана очень
маленькой и расположена близко ко
входу в масс-анализатор (рис. 1.11). Конечным результатом такой простой
корректировки становится увеличение эффективности, которое включает уменьшение
необходимого количества образца.
Скорости потока
для nanoESI обычно составляют ль
десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости
потока, nanoESI использует источники из
вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого
кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в
источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца
с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также,
источники расположены очень близко ко входу в масс-анализатор, поэтому перенос
ионов в масс-анализатор намного более эффективен. Например, анализ 5 mM раствора пептида при помощи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50
фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5
пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI (рис. 1.11.), необходимое для
образования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим
примесям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут
концентрироваться так сильно, как при ESI.[7]
Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
APCI также стала важным способом
ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора и
способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и в
электроспрее, поток жидкости для APCI (рис. 1.12) вытекает непосредственно в устройство ионизации.
Однако сходство
здесь заканчивается. Капли не заряжаются и APCI устройство содержите нагретый испаритель, который обеспечивает быстрое
разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону
ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении.
В APCI ионизация возникает из-за
возбуждения/ионизации растворителя коронным разрядом. Т.к. ионы растворителя
существуют при атмосферном давлении, химическая ионизация молекул аналита очень
эффективна; при атмосферном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента
очень часто. Перенос протона (для реакций протонирования MH+) образует положительные ионы, а
перенос электрона или отщепление протона ([M-H]-) даёт отрицательные.
Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление
газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию
практически только нетронутых молекулярных ионов. Многократная зарядка обычно
не наблюдается, скорее всего, потому что процесс ионизации более энергичен, чем
при ESI.[8]
Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)
Фотоионизация при
атмосферном давлении (APPI) стала сейчас важным способом
ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с
относительно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно
неполярных соединений. Так же, как и APCI, поток жидкости для APPI (рис.
1.13) вводится прямо в устройство ионизации.
Основное различие
между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец проходит через
ультрафиолетовый свет (обычная криптоновая лампа испускает от 10.0 эВ до 10.6
эВ). Часто APPI является намного более
чувствительным, нежели ESI или APCI и показывает более высокое соотношение
сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона. Низкий сигнал фона во многом
обусловлен высоким потенциалом ионизации стандартных растворителей, таких, как
метанол и вода (10.85 и 12.62 эВ, соответственно), которые
не ионизируются
криптоновой лампой.
Недостатком ESI и APCI является то, что они образуют
фоновые ионы растворителей. В дополнение к этому, ESI особенно подвержен эффектам
подавления ионов, а APCI требует испарения при
температурах 350-500°C, что может вызвать
термическое разложение.
APPI производит ионизацию двумя
механизмами. Первый – простое фотовозбуждение, инициирующее испускание
электрона с образованием молекулярного катион-радикала (M+). APPI устройство воздействует светом с энергией выше, чем
потенциалы ионизации (ИП) большинства целевых молекул, но ниже, чем ИП для
большинства молекул растворителей и воздуха, тем самым исключая их как помехи.
К тому же, из-за малой избыточной энергии, сообщаемой молекулам, достигается
минимальная фрагментация.
Второй механизм – фотоиндуцированная химическая ионизация при атмосферном
давлении, которая похожа на APCI в
том, что она включает перенос заряда при протонировании (MH+) или потере протона ([M-H]-).
Для инициирования химической ионизации фотоионизирующийся реагент добавляется
к элюенту. После фотоионизации реагента происходит перенос заряда на аналит. Типичными
реагентами для положительной ионизации являются ацетон и толуол. Ацетон также
служит реагентом для отрицательной ионизации.
Механизм ионизации (M+ или [M+H]+), который претерпевает молекула, зависит от сродства к
протону аналита, растворителя и типа используемого дополнительного реагента.[9]
Масс-спектрометрия
с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы (MALDI-MS) впервые была использована в 1988 году Танакой, Карасом и Хилленкампом.
С тех пор он стал широко распространённым методом для пептидов, белков и
большинства других биомолоекул (олигонуклеотидов, углеводов, природных веществ
и липидов). Эффективный и направленный перенос энергии во время акта
индуцированной лазером десорбции при помощи матрицы приводит к большому выходу
ионов незатронутого аналита и позволяет проводить измерения соединений с
субпикомолярной чувствительностью. Вдобавок, удобство MALDI для анализа гетерогенных образцов
делает его очень привлекательным для масс-анализа сложных биологических
образцов, как, например, гидролизат белков.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|
|