Методы разделения иммуноглобулинов

Методы разделения иммуноглобулинов

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра биохимии

РЕФЕРАТ

«Методы выделения иммуноглобулинов»

Выполнила Сулемейнова Г.

Руководитель: доктор биологических наук,

профессор Жумашев Ж.Ж.

Алматы, 1999 год

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноглобулины - основные защитные белки организма, так как они

обладают свойствами различных антител. Они содержатся в крови, молозиве и

молоке, слюне и других жидкостях. С их количеством и активностью связаны

жизнестойкость, физиологическое состояние и продуктивность животных.

В работе описаны свойства иммуноглобулинов, как белков, а также способы

разделения иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных.

Представленные данные по характеристике, выделению иммуноглобулинов,

могут дать современные представления о защитных белках животных.

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ - СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

Важнейшие факторы специфического иммунитета - иммуноглобулины,

осуществляют гуморальную защиту организма.

Дж.Хереманс (1959), изучая активность иммунной сыворотки человека,

обнаружил, что антитела содержатся, по меньшей мере, в трех фракциях

сыворотки: в (- и в двух фракциях (- глобулинов, называемых (2А и (2М -

глобулинами. Эти фракции, активные в иммунологическом отношении, Хереманс

предложил назвать иммуноглобулинами (Ig). Предложение Дж.Хереманса легло в

основу международной номенклатуры, принятой в 1664 г. специальной

комиссией ВОЗ. По этой номенклатуре (-глобулин называется IgG, B2A-

глобулин - IgA и В2М - IgM. Иммуноглобулин состоит из двух легких (L) и

двух тяжелых (Н) полипептидных целей. Причем каждый класс

иммуноглобулинов характеризуется особым типом тяжелых цепей (, (, (, d, (.

Легкие цепи бывают двух типов - ( или (, каждвй из которых отличается С-

концевой последовательностью аминокислот. Как тяжелые, так и легкие

цепи состоят ив двух различных участков (областей) - вариабельной (V) и

постоянной (С). С-концевая половина полипептидной цепи имеет постоянную

аминокислотную последовательность, а ее N - концевая часть - вариабельную.

Каждый постоянный (Сl) и вариабельный (Vl) участок легкой цепи включает

107-110 аминокислотных остатков.

Тяжелые цепи построены их четырех участков - VH, C1H, C2H, C3H.

Вариабельные участки их состоят приблизительно из 110-114 аминокислотных

остатков, постоянные - 330.

В вариабельной части полипептидных цепей находятся определенные, так

называемые "гипервариабельные участки", с наибольшим числом аминокислотных

замен. В легких цепях они расположены между 24-34; 52-55; 89-97

аминокислотными остатками. Гипервариабельные участки тяжелых цепей

занимают аналогичные положения, но точная локализация их пока не

установлена (Кульберг, 1975; Поляк 1981).

Наличие вариабельных участков дает молекулам антител возможность

приспосабливаться к разнообразным антигенным детерминантам. Строение

постоянных областей тяжелых цепей определяет эффекторные функции молекул к

поверхностям макрофагов. В-лимфоцитов, тучных клеток, а также проникновение

через плацентарную мембрану (Егоров , 1972; Leslie, Cohen, 1973).

Гибкость молекул иммуноглобулинов, обеспечивающая приспособляемость к

различным конфигурациям молекул антигена, обусловливается также наличием

особого "шарнирного участка" в середине тяжелых цепей, содержащего много

остатков аминокислоты пролина и препятствующего образованию вторичной

структуры.

В настоящее время на основании изучения первичной структуры

полипептидных цепей выдвинута так называемая "доменная" гипотеза строения

иммуноглобулинов, согласно которой молекулу иммуноглобулинов можно разбить

на участки с относительно независимыми конфигурациями в виде глобул.

Каждый домен состоит приблизительно из 100-110 аминокислотных остатков и

имеет одну дксудьфидную связь, которая связывает участки цепей, образуя

петлю из 60 аминокислотных остатков (Еdelman, 1970; Незлин, Рохлин,

1970; Роljak, 1972).

Молекула иммуноглобулина G состоит из 12 доменов: по 4 в тяжелых и по

2 в легких полипептидных цепях (рис.1). Используя молекулярные модели и

ряд общих термодинамических принципов укладки третичной структуры белков,

установлено, что конформации всех 12 доменов иммуноглобулина G

характеризуются большим количеством (- складок и наличием одно-двух витков

(- спиральной структуры (Завьялов, Троицкий, 1973).

На основании изучения воздействия протеолитических ферментов сделан

вывод, что молекулы иммуноглобулинов состоят из в трех фрагментов двух

типов, связанных гибкими участками полипептидных цепей: два из них названы

Fab- и один Fc- фрагментами (Рогtег, 1959, 1960; Utsumi Karush, 1955,

1967).

В состав FAB- фрагментов входят целая легкая цепь и N - концевая

половина тяжелой цепи. Структурная особенность FAB- фрагмента наличие двух

глобулярных субъединиц - V и С. V построена из двух доменов VH и V1L, а С-

из CL и C1H. Fc-фрагмент содержит по два домена - C2H и Сн3 (Роljak, 1972).

Рис. 1. Схема строения молекулы IgG1 человека (из книги

Иммуноглобулины".- М.: Мир., 1981).

L- цепи разделены на две гомологичные области VI. (вариабельная) и СL

(константная). Утолщенные линии Н-цепей соответствуют шарнирному участку.

Показаны 4 гомологичные области Н-цепей (VF, С1Н, С2Н, С3Н), внутри - и

межцепочные дисульфидные связи, N- концевые участки обоих цепей и

основные фрагменты (FAB, FAB' и Fc).

В состав молекул некоторых классов иммуноглобулинов входят дополнительно

полипептидные цепи. В молекуле сывороточного и секреторного иммуноглобулина

А она названа J- цепочкой. (НАLPERN, KOSHLAND, 1970). Выяснено, что

аналогичные полипептиды содержатся также и в молекулах иммуноглобулина М

(Меstresky et al., 1971). J-цепочки иммуноглобулинов М и А имеют одинаковые

молекулярную массу, электрофоретическую подвижность, антигенную

специфичность и аминокислотный состав (Меtresky et al, 1971; Моrrison,

Коshland, 1972). В полимерных молекулах иммуноглобулинов различных видов

животных также содержится полипептид, аналогичный полипептиду J- цепочки

иммуноглобулинов человека (Kobajashi et al, 1973).

Молекулярная масса J- цепи колеблется от 14 000- 27000. Такое

расхождение объясняется, по-видимому, склонностью J цепей образовать димеры

(Коshland, 1975). Содержание углеводов в них около 7,5 моль %. Определен

аминокислотный состав J- цепей выделенных из IgA и IgМ человека, а также

животных. Изолированные цепи отличаются высоким содержанием аспарагиновой,

глутаминовой кислот и цистеина и почти полным отсутствием трипто-фана

(Morrison, Коshland, 1972; Zikand 1972; Kehoe et al, 1972; Mestesky et al

1975).

Предполагается, что J цепи необходимы для присоединения секреторного

компонента к IgA и облегчают димеризацию IgA b и полимеризацию IgМ. По

мнению Л.В.Часовниковой и др. (1983), большая информационная стабильность

молекул IgA, по сравнению с IgM обусловлена наличием J- цепи, объединяющей

молекулу IgA в димерную форму.

В состав секреторного IgА входит еще один полипептид, названный

секреторным компонентом (Brandtzaeg, 1968, 1974; Fomasi et al, 1968).

Секреторный компонент обнаружен у всех видов сельскохозяйственных

животных, коров (Mashetal, 19б9; Butler et al, 1972); свиней (Bourle,

1969); кроликов (Halperl, Koshland, 1970); овец и коз (Pahud Mach, 1970);

лошадей (Pahud Mach, 1972). Он существует как в связанном с секреторным IgA

- (сСК), так и в свободном виде - (нСК). Молекулярная масса связанного и

свободного секторного компонентов у человека колеблется от 50 000 до 90

000, у овец, коз и лошадей молекулярная масса нСК 80 000- 85 000 (Pahud

Mach, 1970, 1972). Содержание углеводов - 15,9 - 22,8%. Определен также

аминокислотный состав свободного секреторного компонента у человека,

крупного рогатого скота и собаки (O’Daily, Cerba, 1971; Fomasi, Jrey, 1972;

Mestesky, 1972; Fhopson et al, 1975).

Секреторный компонент связан о шарнирной областью молекулы IgА в зоне

расположения углеводов (Winkelhanke, 1979). Полагают, что его функция

заключается в защите секреторного IgА от воздействия протеолитических

ферментов, что очень важно (Стефани, 1973; Чернохвостова, 1974).

Активные центры - участки молекул, от которых зависит способность

антител специфически связываться с антигеном. Обычно они занимают

небольшой участок (приблизительно 2% от всей поверхности целой молекулы

антитела), который , находясь в Fab- фрагментах, придает молекуле

иммуноглобулина уникальные изменчивость и специфичность (Носсел, 1973).

Известно, что в построении активного центра участвуют только

гипервариабельные участки как тяжелых, так и легких цепей Fab-фрагмента

(Poljak et al, 1973, Padlan et al, 1973; Leslie et al, 1973). При этом

основная роль принадлежит тяжелым цепям, а легкие участвуют в

пространственной организаций тяжелых, препятствуя их агрегации.

Углеводные компоненты. Все классы иммуноглобулинов отличаются друг от

друга количественным содержанием углеводного компонента. Наиболее богаты

углеводами иммуноглобулины М, А, Е и Д (7,5 - 12,0%). В молекулах IgG

содержится около 2,9% углеводов. В составе иммуноглобулинов обнаружены

манноза, галактоза, галактозамин, глюкозамин, фукоза и сиаловая кислота.

Изучение углеводных групп представляет большой интерес, обусловленный

их участием в самосборке молекулы иммуноглобулина М из полимеризующихся

субъединиц ( Каверзнева и др., 1975; Лапук и др., 1975; Хургин и др.,

1975; Каверзнева , 1981; Каверзнева , Чухрова, 1984; Каверзнева, 1984).

Предполагается, что включение глюкозомина и маннозы на раннем этапе

сборки в тяжелую цепь молекул иммуноглобулинов способствует

конформационным изменениям, облегчающим замыкание S-S- связей. Эти углеводы

играют определенную роль при секреции иммуноглобулинов из продуцируемых

клеток (Сидорова, 1971).

Электрофоретические свойства. Иммуноглобулины - наименее заряженные

белки сыворотки крови и обладают малой электрофоретической подвижностью. В

электрическом поле при щелочных значениях среды иммуноглобулины G и его

подклассы занимают область (- гдобулинов, М и А зону ( - глобулинов.

Антигенные свойства. 1. Молекулы иммуноглобулинов имеют различные

антигенные структуры. Все их антигенные детерминанты кодируются тремя

несцепленными группами аутосомных генов. Одна группа кодирует тяжелую цепь

того или иного класса, другая - легкую k- типа, третья - легкую (-типа.

2. Так как полипептидные цепи состоят из двух различных участков-

вариабельного (V) и постоянного (С), каждая из трех групп генов включает

набор генов вариабельной - V и постоянной областей -С-гены. Таким образом,

синтез каждой полипептидной цепи молекулы иммуноглобулина контролируется

двумя структурными генами, а не одним, как при синтезе других белков.

Один ген кодирует вариабельную область цепи, другой- постоянную. Этот факт

дополняет существующее правило "один ген - одна полипептидная цепь"

(Фуденберг и др., 1975). Причем существуют многие гены для вариабельных

областей полипептидной цепи, что связано с многообразием специфических

активных центров.

3. Выяснилось, что V-гены тесно сцеплены c С-генами и располагаются

не только на одной хромосоме», но и в непосредственной близости. Сборка

целой молекулы иммуноглобулина происходит из двух тяжелых и двух легких

цепей ( 2Н2Lк или 2Н2L(), синтезированных по генетическим матрицам,

расположенным в двух разных хромосомах. По некоторым представлениям

(Кульберг, 1985; Петров, 1987), вначале соединяется одна из легкой и

тяжелой цепей, а затем обе части собираются в целую молекулу.

4. Показано, что в одной хромосоме расположены гены, детерминирующие

синтез V- участка тяжелой цепи, а также гены С-участка иммуноглобулинов G,

М, А , т.е. в одной цепочке находятся гены V, С(, С(, С(. Установлено,

чтоVH участок цепи, кодируемый одним геном, может быть обнаружен в составе

IgМ, IgG и IgA, т.е. может быть соединен с постоянными участками тяжелых

цепей разных классов - С(, С(, С(. Вопрос о выборе клеткой V- или С- гена

при синтезе иммуноглобулина изучался многими авторами.(Незлин, 1972, Рохлин

, 1976, Петров, 1982, 1987).

Каждая индивидуальная клетка вырабатывает антитела только одной

специфичности по правилу "одна клетка " одно антитело" (Петров , 1987). Это

означает, что в клетке активно функционируют только один вариант гена VH,

один - гена СH и по одному соответствующему гену одной из легких цепей. Все

остальные структурные гены выключены. В каждой отдельно взятой антитело-

образующей клетке из всего множества структурных генов иммуноглобулинов

функционирует их минимальное количество, необходимое для синтеза антител

одной специфичности и одного типа. Таким образом, в основе многообразия

специфичности антител лежит функционирование в лимфоидной системе большого

количества клеток и их потомков -клонов клеток- продуцентов одного вида

антител. Следовательно, количество специфичностей антител соответствует

количеству клонов клеток- антителопродуцентов, различающихся генами,

функционирующими в них.

Установлено, что V-ген данной специфичности способен поо^ чередно

ассоциировать с генами, кодирующими С(, С(, С(, т.е.антителообразующие

клетки способны переключать синтез иммуноглобулина М на IgG и на IgA, не

изменяя антительной специфичности. Таким образом, антитела против альбумина

быка могут находиться как во фракции IgG, так и во фракциях:

иммуноглобулинов М и А.

КЛАССЫ И ПОДКЛАССЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Как уже указывалось, иммуноглобулины имеют общие характерные свойства.

Однако их отдельные классы и подклассы отличаются первичной структурой,

антигенными и физико-химическими свойствами и биологической активностью.

а) Иммуноглобулины класса G. IgG представляет собой наиболее изученное

антитело, в большом количестве присутствующее в сыворотках крови всех

млекопитающих и птиц. IgG составляет около 70-80% от общего содержания

иммуноглобулинов. Молекулярная масса - 150 000 - 160 000 (Незлин, 1972).

Молекула иммуноглобулина G- построена из двух тяжелых и двух легких

полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями. Характерны

тяжелые полипептидные цепи. IgG человека существует в виде 4 подклассов

(G1, G2, G3, G4, отличающихся строением постоянных участков тяжелых цепей,

а следовательно, и антигенными и биологическими свойствами (Незлин, 1972,

Герман и др., 1977, Басова, Стефани, 1977). Подклассы различаются 2

количеством дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи: в молекулах G1 и

G4 их по 2, в G2, - 4, а в G3, -5. IgG1 составляет 70% от общего содержания

IgG, а IgG2, IgG3, IgG1 18, 8 и 3%, соответственно.

У всех изученных видов животных найдены два подкласса IgG: относительно

медленно передвигающиеся в электрическом поле G2 и более подвижные G1. Их

молекулы имеют различные антигенные и биологические свойства, а также

способность к перевариванию протеолитическими ферментами (Незлин, 1972).

Расшифрована первичная структура обеих цепей иммуноглобулина G1

(Edelman, 1973). Тяжелые цепи его состоят из одной вариабельной области -

VH и 3 постоянных участков - Сн1, Сн2 и Сн3. Длину вариабельных областей

Страницы: 1, 2