Методы разделения иммуноглобулинов 
составляют 114, а постоянных - 330 аминокислотных остатков, легкие из
областей V1, СL.
С помощью электронной микроскопии (Valentine, Jreen, 1967), выяснено,
что молекула иммуноглобулина G имеет V-образную форму, при этом Fab
фрагменты образуют "лапки" молекулы , а Fc- фрагмент - ее "хвост". Она
имеет два активных центра, находящихся в вариабельной части молекулы, а
именно на кончиках Fab фрагментов.
При электрофорезе в щелочных значениях рН IgG передвигается медленнее
всех сывороточных белков. При иммуноэлектрофорезе он образует вытянутую в
дугу линию преципитации, прокрывающую зону расположения (- глобулинов
(Незлин, 1972). Нативная молекула IgG1 обычно не содержит свободных
сульфгидрильных групп (Троицкий и др., 1965, Cristian, 1965). IgG содержит
около 2,9% углеводов, которые находятся в тяжелых цепях (Незлин , 1968).
У человека только IgG способен проникать через плаценту и попадать в
кровеносную систему плода, обеспечивая тем самым пассивный иммунитет
новорожденных в ранний постнатальный период (Брондэ, Рохлин, 1978).
б) Иммуноглобулины класса М. IgМ - один из высокомолекулярных белков
сыворотки крови и имеет молекулярную массу около 1 млн, константу
седиментации 19 Se. Молекула IgМ состоит из 5 субъединиц, каждая из которых
напоминает молекулу IgG (рис. 2). Субъединица состоит из двух тяжелых и
двух легких цепей с молекулярными массами 23 000 и 60 000 соответственно, (-
цепь состоит из 5 доменов VH, С1(- С4(, легкая - изVL, и СL. Молекула 1IgM
имеет 10 активных центров, расположенных в Fab областях ( Прокопенко, Равич-
Щербо, 1974, Литмен , Гуд, 1981).
IgМ содержит около 10% углеводов., функция которых обусловлена с
образованием макромолекулы IgM из 7 S субъединиц к формированием
пространственной структуры молекулы (Каверзнева, 1984). IgМ по рваному
реагирует на восстановление 2- меркаптоэтанолом: при мягком он распадается
на 5-7 S субъединиц, а при более глубоком на тяжелые и легкие полипептидные
цепи.
Рис. 2. Схема строения молекулы IgМ
( из книги "Иммуноглобулины". -М.: Мир, 1981).
Радиальная упаковка субъедикиц IgМ, на одной из которых расположение
гомологичных областей (доменов) L- (VL .и СL) и H--цепей (VH, С1(, С4().
Показаны наиболее важные продукты ферментативной фрагментации IgМ и
предполагаемое положение J- цепи.
Важнейшее свойство молекулы IgМ, необходимое для ее функционирования -
конформационная подвижность при изменении условий внешней среды (Каюшина и
др., 1985, Свергун и др., 1585). При электрофорезе IgМ передвигается
быстрее иммуноглобулинов класса G во фракции (2- глобулинов. Найдено 2
подкласса IgМ, с различными антигенными свойствами (Гауровец, 1969,
Бернет, 1971, Незлин , 1972, Кульберг , 1975).
Не менее значительно нахождение его на поверхности (-лимфоцитов в
качестве их основных рецепторов (Петров, 1987). IgM обнаружен у всех
исследованных позвоночных (Koshland, 1975). У человека после 45 лет
содержится 1,71 мг/мл IgМ или около 10% от общего количества
иммуноглобулинов (Стефани, Вальтищев, 1977). IgM- антитело первичного
иммунного ответа, так как синтезируется первым после антигенной стимуляции.
Через несколько дней синтез IgМ переключается на IgG, а позже -на IgА
(Петров , 1987).
IgM в основном имеет внутрисосудистую локализацию, небольшое
количество его обнаружено в тканевых жидкостях, но в слизистых выделениях
он обычно отсутствует (Jonas, 1972). У большинства же животных (кроме
кроликов) IgM через плаценту проходить не может ( Маслянко , 1973).
в) Иммуноглобулины класса А. IgA впервые идентифицирован в сыворотке
крови человека иммуноэлектрофорезом как (2А-глобулин (Burtin et al, 1957,
Грабар, Буртэн, 1963).
Иммуноглобулин А- один из наименее изученных защитных белков
человека и животных. Это объясняется исключительно низким его содержанием в
нормальной сыворотке крови, трудностями выделения, а также некоторым
сходством с иммуноглобулинами класса 6 и другими белками
неиммуноглобулиновой природы.
Существуют компоненты IgА с константами седиментации 7S, 11S, 13S,
15S5, 17S. В полимерных формах иммуноглобулина А (рис. 3) обнаружен
дополнительный полипептид J цепь (Halpern, Koshland, 1970).
Рис.3 Строение молекулы IgA
(из книги Р. В. Петрова "Иммунология". -М.: Медицина, 1987).
SС- секреторный компонент; j- соединяющая; H-тяжелые; L-легкие цепи
В нормальной человеческой сыворотке найдены два антигенно различающихся
подкласса IgA - А1 и А2 (Vaerman, Hereman, 1966, Kunkel, Prentergast,
1966, Feinstein, Franklin, 1966, Fomasi, Yrey, 1972). IgA2 существует в
виде димеров, соединенных дисульфидной связью, а тяжелые и легкие цепи
связаны нековалентными связями (Yrey et al, 1968, Незлин, 1982). Оба
подкласса IgA обладают активностью антител (Dorrington, Fanford, 1970,
Бернет, 1971). Молекулы IgА, содержащиеся в различных секретах - молоке,
молозиве, пищеварительных соках, слюне, моче и т.д., имеют константу
седиментации 11S и содержат дополнительную полипептидную цепочку-
секреторный компонент с молекулярной массой 50 000 - 60 000 (Brandt et
al, 1968, 1975, Fomasi et al, 1965, 1968).
Иммуноглобулины А слюны и пищеварительного тракта устойчивы к действию
протеолитических ферментов - пепсина и трипсина (Ballierex et al, 1969,
Porter, Noakes, 1970). Эта резистентность связана с присутствием
секреторного компонента синтезированного в выделяющей секрет железе и затем
присоединенного к молекуле IgA с образованием димеров из двух его молекул
(Стефани, 1973, Чернохвостова, 1974, Першин, 1980).
Поэтому в секретах IgA обычно находится в виде димеров или тримеров
Гаврилова , 1976). Мономеры IgА имеют молекулярную массу 160 000. IgА у
некоторых видов животных имеет более высокую электрофоретическую
подвижность, чем IgМ. Содержание углеводов высокое -10%. Молекулярная
масса в основном, одинакова с IgG1, а у некоторой части популяции молекул
IgA она промежуточная между IgA и IgM. Как и у других иммуноглобулинов,
восстановление приводит к распаду молекулы на тяжелые и легкие цепи.
Характерны тяжелые цепи.
IgA в сыворотке крови человека содержится в относительно большем
количестве, чем IgМ и составляет около 19% от общего количества
иммуноглобулинов (Hobby, 1971). В сыворотке крови многих видов
животных, в частности овец и крупного рогатого скота, IgM преобладает над
IgA. Значительное количество этого белка обнаружено в лимфе, где
концентрация его в 2-18 раз выше, чем в крови (Стефани, 1971). Антитела
найдены и в содержимом кишечника и фекалиях, 80% которых приходится на
долю IgА. Антитела, выделяющиеся в кишечник в устойчивой к гидролизу форме,
играют важную роль в защите организма от кишечных инфекций (Fomsi, Yrey,
1972). IgА находится на поверхности слизистых оболочек и активно участвует
в местной иммунологической защите (Герберт, 1974).
г) Иммуноглобулины класса D. IgD также изучен недостаточно. Впервые он
охарактеризован как четвертый класс иммуноглобулинов D.Rowe, G.Fahey
(1965). Его молекулярная масса около 180000. Молекула IgD состоит из двух
легких и двух тяжелых полипептидных цепей, связанных дисульфидными
мостиками (Vunnar, Fohansson, 1969, Spiegelberg, 1977, Ruddick, Leslie,
1977). Роль в организме человека почти не изучена. Полагают, что он -
секреторный иммуноглобулин. Сывороточный IgD обнаружен только у человека и
приматов. При электрофорезе в агаровом геле подвижность IgD соответствует
подвижностям ( и ( глобулинов. Точных экспериментальных данных о
присутствии IgD у животных пока не имеется.
д) Иммуноглобулины класса Е. IgE впервые идентифицирован K. Ishisaka,
F. Fshisaka (1966). Молекулярная масса IgЕ 190 000, константы седиментации
8 S. Молекула IgE также состоит из двух легких и двух тяжелых
полипептидных цепей, молекулярная масса которых 22 600 и 72 500
соответственно. Содержание углеводов свыше 12% (Шаханина, Стоев, 1981).
IgE играют важную роль в патогенезе аллергии (Isgizaka, Ishizaka, 1976,
Dorrington, Bennich, 1978). К.Г.Стоев (1979) разработал методы выделения и
количественного определения D и Е иммуноглобулинов в сыворотке крови
здоровых и больных людей.
ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Для выделения иммуноглобулинов из сыворотки крови животных, особенно
G1, М и А, применяют различные методы получения предварительно очищенных
белков, обогащенных соответствующими иммуноглобулинами. Дальнейшую
очистку проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- сефадексе А-50, ДЭАЭ-
целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацией на сефедексе G-200 или препаратным
электрофорезом.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОЧИЩЕННЫХ
ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
С этой целью обычно применяют методы предварительного выделения
иммуноглобулинов.
ОСАЖДЕНИЕ 4 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА АММОНИЯ
4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыворотки, включая
альбумин.
В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов G1 и G2 и
значительное количество IgМ и IgА , хотя последние обычно обнаруживаются и
в надсадочной жидкости. Поэтому осадок, полученный 4 М раствором сульфата
аммония, может служить источником приготовления всех классов
иммуноглобулинов, что имеет большое значение, особенно для выделения их из
одной пробы сыворотки.
ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ
К холодной сыворотке крови добавляют равный объем холодного 2,78 М
раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С 2 ч. Сладок растворяют в
изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При этом 2,78
М раствором сульфата аммония в основном осаждаются иммуноглобулины класса
G. Причем , такая концентрация соли осаждает IgG2 и , что очень важно,
наиболее полно IgG1 при минимальном осаждении фракций (- и (-
глобулинов. Поэтому данный метод наиболее удобен для выделения
иммуноглобулинов G1 и G2 как из сыворотки крови лошадей, так и овец и
крупного рогатого скота.
ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА
АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА
Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в
1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной
мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды
промывают 1,39 М раствором аммония.
При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются
иммуноглобулины G1 и G2, однако иммуноглобулин G1, (- и (- глобулины
присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей,
главным образом выделяется иммуноглобулин G2, IgG(Т) присутствует лишь в
небольшом количестве.
Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором сульфата аммония
путем диализа удобен для выделения IgG2 из сыворотки крови овец и крупного
рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается из сыворотки крови
лошадей.
ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ
К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холодный 2,53 М
раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают
2 час в холодильнике, осадок растворяют и диализируют. 1 М раствором
сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, практически свободные
от фракции (-глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и
выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 из сыворотки крови овец и
крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация
соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G1. По составу,
препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому
1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для
выполнения иммуноглобулина G2.
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50
Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50
типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ
-сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером,
рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями
(Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).
Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле, где в зоне (
-глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные ( -глобулиновые фракции
- IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG1,
IgG2 и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не
получили чистые фракции IgG1 и IgG2 из сыворотки крови овец и крупного
рогатого скота, а только их смесь.
Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработали способ выделения
чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ
-сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако
З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить
иммунохимически чистый иммуноглобулин G2 из сыворотки крови лошадей. Им
удалось выделить смесь белков состоящую из IgG2 и IgМ и IgА. Аналогичные
результаты получены при выделении IgG2 из из нормальной сыворотки овец
(Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).
Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому
, обусловлены особенностями белкового состава сыворотки крови этих видов
животных. Таким образом, указанный метод - также способ предварительного
выделения IgG2 из нормальной сыворотки крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение необходимо отметить, что американскому биохимику G.Edelman
(1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области
изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия
1972 года. Присуждение Нобелевской премии указывает на большое внимание
мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение
определенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.
Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных, то, к
сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного
определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.
Главный защитный белок сельскохозяйственных животных IgG. Причем он
существует в виде двух подклассов: G1 и G2, которые различаются
аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, антигенным и
биологическим свойствам. Однако выделение из сыворотки крови чистых
препаратов IgG1 - очень сложная, и следовательно, не до конца решенная
проблема.
Поэтому большинство литературных данных по этому вопросу касается IgG и
лишь немногие IgG1 и IgG2.
IgM один из высокомолекулярных и сложноорганизованных белков сыворотки
крови, состоящий из 5 субъединиц, соединенных лабильными дисульфиными
связями. Этим и объясняется трудность его выделения и изучения. Хотя
существуют несколько современных методических приемов, помогающих его
выделению, ни один из них в отдельности не обеспечивает получения чистого
IgМ. Поэтому необходимо использовать комбинированные методы, основанные на
особенностях его физико-химических свойств.
Так, до сих пор остается сложной задачей приготовление высокоочищенного
IgМ, пригодного для изучения его структурных особенностей и аминокислотного
состава, антигенных свойств, а также получение к нему моноспецифических
иммунных сывороток. По-видимому, этим и объясняется отсутствие работ по
изучению пептидной структуры и аминокислотного состава IgМ у различных
видов животных. Относительно мало работ, выполненных с помощью
моноспецифических иммунных сывороток к IgM у животных, особенно у лошадей и
овец.
Однако особый интерес, особую сложность для выделения представляет IgА,
в частности у жвачных - крупного рогатого скота и овец. Это прежде всего
связано с его небольшим содержанием в нормальной сыворотке крови. IgА
относительно хорошо изучен только у человека благодаря появлению гибридом
и моноклональных антител.
Изучение IgА у сельскохозяйственных животных начато недавно. Так, не
изучены его структурные особенности и аминокислотный состав, слабо -
электрофоретические, хроматографические и гель-фильтрационные свойства и
молекулярные размеры.
Изучение иммунологического статуса животных методом радиальной
иммунодиффуэии с использованием моноспецифических иммунных сывороток имеет
практическое значение. Однако в настоящее время почти отсутствуют
исследования по установлению уровня иммуноглобулинов у отечественных пород
крупного рогатого скота, овец, лошадей и других сельскохозяйственных
животных. Неизвестно также, как изменяется количественное соотношение
иммуноглобулинов в зависимости от породы, пола, возраста, сезонов года и
продуктивности животного. Пока мало исследованы иммуноглобулиновый спектр
новорожденных и динамика содержания иммуноглобулинов в возрастном аспекте,
особенно у лошадей и овец.
Изучение иммуноглобулинов человека показало, что во многих случаях
нарушается биосинтез иммуноглобулинов, обусловливающий изменения
нормального соотношения их в сыворотке. Такие исследования проведены
только у человека и отсутствую у сельскохозяйственных животных. Пока не
изучены и качественные и количественные изменения состава иммуноглобулинов
при различных заболеваниях инфекционного и инвазионного характера.
Слабо изучена природа иммунного ответа у вакцинированных животных,
особенно крупного рогатого скота и овец. Многочисленные исследования общего
белка и его фракций у различных животных проведены главным образом методом
электрофореза на бумаге, который имеет ограниченную аналитическую
возможность. Это справедливо в отношении динамики белковых фракций
сыворотки крови у молодняка сельскохозяйственных животных в возрастном
аспекте, а также иммуноглобулинового, белкового и казеинового состава
молозива и молока овец и лошадей.
Таким образом, исследование иммунохимических особенностей и
количественного содержания иммуноглобулинов сельскохозяйственных
животных имеет как теоретическое, так и практическое значение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Басова Е.Н., Стефани Д.В. Некоторые особенности выделения миеломных
IgG человека различных субклассов и их распределение по аллотипам,
субклассам и типам легких цепей// Журн. микробиолог. - 1977. - №5. - С. 77-
81.
2. Басова Е.Н., Стефани Д.В., Казанцева Л.З. Иссчледования субклассов
IgG человека. Сооб.II. Уровни отдельных субклассов IgG в парных сыворотках
крови жителей северного села - изолята// Журн. микробиолог. - 1979. - №7. -
С. 35-39.
3. Бернет Ф. Клеточная Иммунология. - М.: Мир, 1971. - 549 с.
4. Edelman J.M. Antibody structure and molecular immunology//Nobel
lecture. Dec. 12 1972; Stocholm, 1973. - p. 147-170
5. Heimer R., Clark L.C., Mourer P.H. Immunoglobulins of sheep//Arch.
Biochem. Biophys. - 1969 - v.131. - p. 9-17.
6. Kehoe J.M., Tomosi T.B., Ellous F., Capra J. Identification of J-
chain in a homogeneous canine IgA immunoglobulin//J. Immunol - 1972 - v.109
- p.59-64.
7. Menta P.D., Reichin M. Comparative studies of vertebrate
immunoglobulins//J. Immunol - 1972 - v.109 - p.1272-1277.
8. Ж.Ж.Жумашев, М.Б.Бабаев, Ш.С.Алимжанова, М.А.Туганбекова.
Иммуноглобулины животных. Алматы. 1994.
Страницы: 1, 2
|
