Изучение свойств бактериальной суспензии и ее применение в подготовительных процессах переработки мехового сырья

2.2.8 Приготовление бактериальной суспензии

Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см3.

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (385)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см3 соответствующей жидкой синтетической среды.

Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки.

2.2.9 Определение протеолитических свойств микроорганизмов

Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.)

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок (МПЖ, молоко и др.)

Посевы в МПЖ культивируют 5...7 суток при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, кратерообразное, реповидное, в форме чулка и т. д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина.

2.2.10 Определение индолообразования

Определение индола проводят по методу Морелли, путем использования полосок фильтровальной бумаги, смоченных горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (12 %-ным) и высушенных термостате. Бумажки помещали под пробку в пробирку с бульонной культурой. Культуру выращивают в течении трех суток в термостате, после чего определяют резуьлтаты взаимодействия продуктов жизнедеятельности микроорганизмов с щавелевой кислотой. Положительная реакция - порозовение нижней части бумажки.

2.2.11 Обнаружение сероводорода

Для обнаружения сероводорода делается посев уколом (внутрь столбика) по стенке в агар с ацетатом свинца (МПА с 5 % пептона и 0,25 % ацетата свинца) или в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещается полоска стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде или на фильтровальной бумажке (в МПБ).

2.2.12 Определение аммиака

Определение аммиака начинают с того, что под пробирку с бульонной культурой помещают розовую лакмусовую бумажку, культуру термостатируют при 370С в течение 1...3 суток. При наличии аммиака лакмусовая индикаторная бумажка приобретает синюю окраску.

2.2.13 Определение редуцирующей способности

Редуцирующую способность определяют посевом культуры на молоко с метиленовым синим. К стерильному молоку добавляют по капле 1 %-ный водный раствор метиленового синего до голубого окрашивания. После культивирования засеянного материала бактерии, обладающие редуцирующей активностью, обесцвечивают лакмусовое молоко (под редукцией понимают химический процесс, заключающийся в отщеплении от вещества кислорода или присоединении к нему водорода).

2.2.14 Определение каталазы

Для определения каталазы в 3...5 суточную бульонную культуру, выращенную в пробирке, вносят 1 см3 3 %-ного раствора пероксида водорода. При наличии фермента каталазы обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется так называемая “пенистая шапка”.

2.2.15 Определение сахаралитической способности («пестрый» ряд)

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического обмена. Для идентификации большинства гетеротрофных микроорганизмов необходимо определить, какие углеродсодержащие вещества обеспечивают рост данного организма и какими изменениями среды сопровождается его рост.

Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и спирты - глицерин и маннит.

Готовят среду основного состава на водопроводной воде (г/дм3): пептон - 5,0; гидрофосфат калия (К2НРО4) - 1,0 и индикатор Андреде: кислый фуксин - 0,5; вода - 100 см3; нормальный раствор гидроокиси натрия - 16,4 см3.

Среду разливают в пробирки по 9 мл в каждую и стерилизуют при 1 атм. Углеводы и спирты рекомендуется стерилизовать отдельно при давлении 0,5 атм в виде 10 %-ных водных растворов и добавлять после стерилизации к стерильной среде в количестве 1 %. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать фильтрованием, чтобы избежать их гидролиза при высокой температуре.

Среды с углеводами и спиртами засевают одновременно 0,1-0,2 мл суспензии клеток изучаемого микроорганизма и ставят в термостат. Если микроорганизм развивается быстро, то результаты можно регистрировать через 48-96 часов, а если медленно - через 7-10 суток.

Визуально по помутнению среды, образованию плёнки, осадка отмечают рост или его отсутствие на всех использованных средах. Рост на средах с этими соединениями может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот отмечают по изменению рН среды; образование газов - по появлению на поверхности среды пены или в толще среды “глазков”, или по “газовкам” (маленьким пробиркам - ампулам, опускаемым на дно пробирок с жидкой средой и направленным закрытым концом вверх). При рН 6,0 индикатор Андреде жёлтого, а при рН 7,0 синего цвета (соответственно при восстановлении цвет раствора меняется от соломенного до розового - малинового).

Результаты сравнивают с контрольной средой, не содержащей ни углеводов, ни спиртов.

На основании полученных результатов делают заключение о том, какие углеводы и спирты использует изучаемый организм.

Также могут использоваться среды Гисса с индикатором Андреде, полужидкие среды с индикатором “ВР” (водно-голубой краситель, обесцвеченный розоловой кислотой) и различные индикаторы: нейтральный красный, лакмус, фуксин основной и т.д.

2.2.16 Определение липолитической активности

Липолитические свойства культуры исследуются на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см3 МПБ добавляют 1 см3 глицерина и приливают 2см3 свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).

Культуры культивируют в термостате при 37 0С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.

2.2.17 Определение активной реакции среды

Активная реакция среды, т.е. степень ее кислотности или щелочности, характеризуется качественно концентрацией водородных ионов. Концентрацию ионов водорода выражают величиной рН.

Величину рН определяют потенциометрическим методом при помощи потенциометра со стеклянными электродами.

Перед началом измерений прибор включают в сеть при помощи тумблера и дают нагреваться в течение 20 минут.

Электроды перед погружением в раствор тщательно промывают дистиллированной водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Вначале измерение проводят по шкале от 0 до 14 (грубое определение), а затем переключают прибор на более узкий интервал.

Перед измерением рН сточную воду хорошо перемешивают и измеряют температуру для введения необходимых поправок.

2.2.18 Гидролиз (омыление) жира

В фарфоровую чашку или стакан помещают 3-4 г жира, 3-4 см3 спирта (образуя гомогенную массу с жиром и щелочью) и 5-6 см3 30%- ного раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают на плите или спиртовке с асбестовой сеткой, постоянно перемешивая стеклянной палочкой до однородной массы. Перемешивание прекращают, нагревают еще 10 минут, без кипения смеси. Образование мыла судят по появлению пены на поверхности раствора. Омыление происходит по следующей реакции:

CH2?O ?CO ?R1 CH2OH

| |

CH? O ?CO ?R2 + 3 NaOH > CHOH + 2 R1COONa + R2COONa

| |

CH2? O ?CO ?R1 CH2OH

2.2.19 Определение содержания несвязанных жировых веществ (ГОСТ 26129-84 Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Методы определения несвязанных жировых веществ)

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5-0,6 г взвешенною с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в бумажную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с обратным холодильником. В колбу заливают 50 см3 хлороформа или дихлорэтана. Колбу с растворителем нагревают на электрической плитке с асбестовым покрытием. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани - 45 минут, при анализе волоса - 15-20 минут. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждаясь и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. В дальнейшем растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128-130?С. Продолжительность первой сушки 30 минут, последующих - по 15 минут.

Массовую долю жировых веществ вычисляют по формуле (7):

Х1 = Ч100, (7)

где Х1 - массовая доля жировых веществ;

m - масса колбы с экстрагированными веществами, г;

m1 - масса пустой колбы, г;

m2 - масса навески кожевой ткани или волоса, г

2.2.20 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом ассиметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть рисунок 4.

Рисунок 2 - Схема отбора проб методом асимметрической бахромы

2.2.21 Определение колористических показателей волосяного покрова

Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3.

Предварительно прибор прогревают в течение 30 минут, затем нажатием кнопки «сброс» очищают панели вывода.

Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную - на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца - дистиллированную воду, нажимают пуск.

Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск»,

3. Экспериментальная часть

При обработке пушно-мехового и овчинно- шубного сырья на предприятиях меховой промышленности образуется значительное количество сточных вод, характер которых определяется спецификой технологических процессов, осуществляемых в конкретном производстве. Сточные воды образуются после проведения основных жидкостных процессов: отмока, обезжиривание, пикелевание, дубление, крашение и т.д.

В них содержатся химические материалы, как вносимые для проведения технологического процесса, так и образующиеся в результате переработки мехового сырья. Так, после обезжиривания шкур овчины, сточные воды наряду с поверхностно-активными веществами, формальдегидом содержат значительное количество жировых веществ.

В настоящее время все большее применение находит биологическая очистка, основанная на способности микроорганизмов использовать загрязнения в качестве источников питания в результате своей жизнедеятельности. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, исследование деструкции жиров на основе метода потенциометрического титрования, а также возможности применения бактериальной суспензии этих микроорганизмов в процессе обезжиривания меховой овчины.

3.1 Изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества

Для изучения морфологических и культуральных свойств микроорганизмов методом разведений на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана (п.2.2.1), в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир, были выделены чистые культуры микроорганизмов в чашках Петри (п.2.2.2-2.2.3). Культивирование проводили в термостате при температуре (37±0,5)?С в течение 24. Выделенные культуры были обозначены как: Нв - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; Н - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В - выделенные из шерстного жира; 3,7- культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

По методам Грама, Трухильо (наличие спор), Леффлера (количество жгутиков) (п.п. 2.2.4), были изучены морфологические свойства путем окрашивания и микроскопирования мазков колоний.

Результаты изучения морфолого-культуральных признаков бактерий представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9