Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы
Задачи инженерной
энзимологии заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов,
их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными
свойствами и разработке научных основ их применения. В частности, методами
белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры
природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима
или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра
и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические
свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле
лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную
малатдегидрогеназу. Созданы гибридные формы ферментной системы, ценной в
иммуноферментном анализе, сочетающие в себе свойства β-галактозидазы и β-галактокиназы.
Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов
получения и использования иммобилизованных ферментов.
Иммобилизованные
ферменты
Иммобилизованными
ферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем,
но сохраняющие свои каталитические свойства[7].
Ещё в 1916 г.
Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная на
угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер
и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина,
РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем. В 1971 г. на первой
конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные
ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более
широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно – полное или
частичное ограничение движения белковых молекул.
Иммобилизованные
ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего,
такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются
от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают
непрерывность каталитического процесса. Иммобилизованные ферменты долговечны и
в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.
По Дж. Порату
(1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны
обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической
и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью,
как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции;
способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную
форму). В зависимости от природы носители делятся на органические и
неорганические материалы.
Иммобилизация
многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы.
Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса:
природные и синтетические полимерные носители. Среди природных полимеров
выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических –
полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.
К
преимуществу природных носителей следует отнести их доступность,
полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам – биодеградируемость и
достаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто
используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания
химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают
эпихлоргидрином. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами
(формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель –
губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. Из
природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют
хитин. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли
структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт
переработки коллагена – желатин.
К синтетическим
полимерным носителям относятся полимеры на основе стирола, акриловой
кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры.
Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической
прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких
пределах величины пор, введения различных функциональных групп.
В качестве носителей
неорганической природы наиболее часто применяют материалы из стекла, глины,
керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их
можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой
оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими
полимерами. Основное преимущество неорганических носителей – легкость
регенерации.
Существуют
два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения
ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы
иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы
иммобилизации).
При адсорбционной
иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за
счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных
связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон,
Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала
наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов
в промышленности. Процесс адсорбции ферментов достигается при контакте водного
раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании,
динамическим способом с использованием колонок). К недостаткам адсорбционного
метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При
изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его
потеря и загрязнение продуктов реакции.
Способ
иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру
полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и
уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных
ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток.
Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае
фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в
результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с
включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в
раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное
состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта,
поливинилпирролидона, силикагеля, для второго – гели крахмала, агар-агара,
каррагинана, агарозы, фосфата кальция. Метод непригоден для иммобилизации
ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.
Сущность
способа иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры заключается в
отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью
полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и
кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько
модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование
и включение ферментов в липосомы. Первый способ предложен Т. Чангом в 1964 г.
и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой
микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из
механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента
заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из
которых растворено в водной, а другое – в органической фазе. Примером может
служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем
поликонденсации гексаметилендиамина – 1,6 (водная фаза) и галогенангидрида
себациновой кислоты (органическая фаза).
nН2N(CH2)6NH2+nClC(O) (CH2)8C(O) Cl = (-NH(CH2)6NHC(O) (CH2)8C(O)-)n+2nHCl
К недостаткам
метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять
превращения высокомолекулярных субстратов.
Близким к
инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных
растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или
ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был
применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в
1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина)
упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов
диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования
происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный
раствор фермента. Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру
липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо
значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса
биологических мембран.
Иммобилизация
ферментов путем образования новых ковалентных связей между
ферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленных
биокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизации
обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто
сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента
относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические
трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя
с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают
бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин,
сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Все методы химической
иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы
носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.
1)
Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами.
Наиболее
распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и
полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является
бромциановый метод, который был предложен Р. Аксеном, Дж. Поратом и С. Эрнбаком
в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные
цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными
аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов.
Н-OH+BrCN = H-OCN+H2N-Ф=H-OC(NH) – NH-Ф
2)
Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами.
Первичные
аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно
превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям
сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные,
гуанидиновые, тиольные группы белков. Н-N2++H2N-Ф = H-N=N-NH-Ф+Н+
3) Иммобилизация
на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы.
Наиболее
часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя
используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие
производные карбоновых кислот.
Н-С(О) Cl+H2N-Ф = H-C(O) NH-Ф+НCl
4)
Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами.
Сульфгидрильные
группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей
под действием кислорода воздуха.
H-SH+0,5О2+HS-Ф = Н-S-S-Ф+Н2О
Наряду с
иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется
иммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что при
использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки
ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения
полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие
процессы.
Промышленные
процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток
Получение
глюкозофруктозных сиропов.
Первая
промышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощью
иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. Исходным
сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе
кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для
конструирования промышленного биокатализатора глюкоизомеразу сорбируют на
пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Возникающий в
результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42–45%
фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости
соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы.
Получение L-аминокислот из их
рацемических смесей.
Наряду с
микробиологическими способами важное значение имеют химические методы
промышленного получения природных аминокислот, в том числе незаменимых. Однако
в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот,
содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как
D-, так и L-стереоизомеры, т.е.
всегда возникает рацемическая смесь. Разделение рацемических смесей на
составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось
первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот
процесс был осуществлен в Японии в 1969 г.с помощью аминоацилазы,
иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном
превращении используют N-ацилированные производные D-, L – аминокислот,
получаемые с помощью химического синтеза. Аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя
от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко
возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими
методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в
исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента.
Аминоацилаза
строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и
та же установка с иммобилизованным ферментом используется для получения
различных аминокислот.
Получение L-аспарагиновой кислоты.
Аспарагиновая
кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и
подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из
получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в
Японии. В ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки
кишечной палочки E.coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу.
H4NOOC-CH=CH-COOH
= HOOC-CH2-CH(NH2) – COOH
Получение L-аланина.
В настоящее
время основной промышленный способ получения L-аланина – ферментативное
декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты. Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется
аспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в
полиакриламидном геле.
HOOC-CH2-CH(NH2) –
COOH = CH3-CH(NH2) – COOH+CO2
Усовершенствование
процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном
случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух
последовательно расположенных колонках. На первом этапе фумарат аммония
превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды
на втором этапе претерпевает β-декарбоксилирование с образованием аланина.
Получение L-лизина
Процесс
получения лизина основан на стереоспецефическом ферментативном гидролизе
(конверсии) D-,
L-α-амино-ε-капрлактама,
который сначала получают химическим путём из циклогексена. Рацемат используют в
качестве субстрата, который под действием лактамазы превращается в L-лизин, а
непрореагировавшая D-форма переводится в смесь антиподов рацемазой. Лактамаза найдена
у некоторых дрожжей (Candida laurentil). Рацемаза обнаружена у ряда бактерий (Alkaligenes obae).
Получение
триптофана
Химико-ферментативный
способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и ПВК.
Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у E.coli.
Получение L-яблочной кислоты.
Яблочная
кислота – заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах.
Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле
клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит
присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты.
HOOC-CH=CH-COOH+H2O
= HOOC-CH(OH) – CH2-COOH
Перспективы
технологии иммобилизованных ферментов[4]
Сегодня в
промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе
иммобилизованных ферментов (глюкоизомеразы, аминоацилазы, пенициллазы и
лактазы). В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы
для следующих целей.
1.
Холинэстераза
может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого
фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или
колориметрическими методами.
2.
Иммобилизованная
диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для
обезвреживания фосфорорганических нервных газов.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
|